余甘子叶中槲皮素的定性定量分析研究

作者：钟振国，李学坚，董明姣，刘布鸣，陈明生，

林霄，韦燕飞，韦勇汉，陆盛胜，黄金兰，罗雪菲，钟益宁

【摘要】 目的对余甘子叶中槲皮素进行分析研究，建立定性定量分析方法，为余甘子叶的质量标准制定提供方法和依据。方法采用薄层色谱进行定性鉴别;采用液相色谱测定余甘子叶中槲皮素的含量：色谱柱为C18柱，流动相为甲醇-0.2%磷酸(50∶50)，流速1.0 ml/min ，检测波长为360 nm，外标法定量。结果槲皮素在10～100 μg/ml范围内呈线性关系，平均回收率为101.0%(RSD=1.89%，n=9);分别对不同产地的样品进行了测定。结论该方法简便、准确，专属性强，重现性、回收率好，可作为余甘子叶药材的质量控制方法。

【关键词】 余甘子叶;槲皮素;薄层色谱;液相色谱

余甘子叶为大戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus embllca L.的叶，余甘子树广泛分布于我国的广西、广东、福建、贵州、云南等地。余甘子为传统民族用药，具有清热凉血、消食健胃、生津止咳之功效，用于治疗血热血淤、消化不良、腹胀、咳嗽、喉痛、口干[1]。余甘子中含槲皮素[2]，但对余甘子叶未见研究报道。我们研究发现余甘子叶中也含槲皮素，本实验采用薄层色谱法和液相色谱法，以槲皮素为对照，对余甘子叶进行了定性定量分析方法研究，并对不同产地的样品进行了分析比较，为该植物的进一步开发利用提供基础化学数据，为余甘子叶药材及其制剂的质量标准研究奠定基础和依据。

1仪器与材料

1仪器与试药

美国Waters 515 HPLC Pump、2487 DualλAbsorbance Detector液相色谱仪，威玛龙色谱工作站;KQ5200B型超声清洗器;硅胶G，青岛海洋化工厂;槲皮素对照品(756-200211，由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用);水为超纯水，甲醇为色谱纯;其它试剂均为分析纯。

1.2样品余甘子叶采自广西各地，经广西中医学院刘寿养教授鉴定为大戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus Embllca L.的叶，晾干。

2方法与结果

2.1薄层色谱鉴别取余甘子叶粉碎，称取1 g，加70%乙醇50 ml水浴回流1 h，取出，滤过，滤液蒸干，残渣加40 ml水充分溶解，滤过，滤液用乙醚萃取2次，30 ml/次，弃乙醚层，水溶液加5 ml稀盐酸回流1 h，取出，用冷水立刻冷却，滤过，滤液再用乙醚萃取2次，30 ml/次，收集乙醚提取液，滤过，蒸干，残渣用1ml醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液。作另取余甘子叶对照药材同法制成对照药材溶液。再取槲皮素对照品，加甲醇制成毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[3]试验，吸取上述各种溶液各1～2 μl，分别点于同一含羧甲基纤维素纳为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷以2%AlCl3乙醇溶液，105℃烘至显色，置365 nm灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上显相同的黄色荧光斑点，Rf=0.45，见图1。经多批样品试验，薄层色谱的重复性好，可作为余甘子叶的定性鉴别方法。1、2、3.余甘子叶4.槲皮素对照品5.余甘子叶药图1薄层色谱图

2.2含量测定

2.2.1液相色谱测试条件色谱柱为迪马C18柱，流动相为甲醇-0.2%磷酸(50∶50)，流速1.0 ml/min，检测波长360 nm，柱温室温，进样量10 μl。

2.2.2色谱条件与系统适用性实验检测波长：取槲皮素对照品适量，以流动相为溶剂，用紫外分光光度计在200～450 nm波长范围内扫描，测得槲皮素最大吸收波长为360 nm，故检测波长选择360 nm，与文献报道槲皮素的检测波长相同[3]。系统适用性：在本色谱条件下，理论板数按槲皮素峰计算不低于4 000，槲皮素峰与相邻组分色谱峰达到完全分离，分离度大于1.5，槲皮素保留时间约为16 min。样品与对照品色谱见图2~3。图2槲皮素对照品色谱图

2.2.3提取条件的选择取同一批余甘子叶，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入5%盐酸的甲醇溶液25 ml，称量，超声1 h，补重，过滤，水浴蒸干，加甲醇溶解至25 ml量瓶定容，用微孔滤膜(0.45 m)过滤取续滤液，得供试品1。同法系列加入30%甲醇，50%甲醇，70%甲醇，甲醇各25 ml，得供试品2，3，4，5。采用HPLC法测得供试品中槲皮素的含量，结果见表1。结果表明用5%盐酸甲醇溶液超声1 h提取，对余甘子叶中槲皮素提取效果最好。图3余甘子叶供试品色谱图表1余甘子叶不同提取条件测定结果

2.2.4溶液制备对照品溶液的制备：精密称取10 mg槲皮素标准品，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液;精密吸取储备液0.4 ml，置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为槲皮素对照品溶液(40 μg/ml)。供试品溶液的制备：精密称取余甘子叶药材粉末0.2g，置50 ml锥形瓶中，精密加入5%盐酸的甲醇溶液25 ml，称量，超声1 h，用5%盐酸的甲醇溶液补重，过滤，水浴蒸干，加甲醇溶解至25ml量瓶中，定容至刻度，用微孔滤膜(0.45 m)滤过，作为供试品溶液。

2.2.5线性关系考察分别精密吸取对照品储备液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml置于10 ml量瓶中，定容后摇匀，得10，20，40，60，80，100 μg/ml系列浓度对照溶液，按上述色谱条件分别注入色谱仪10μl，测定槲皮素峰面积，以槲皮素峰面积(Y)为纵坐标，以槲皮素进样浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线并求得槲皮素标准曲线回归方程为Y=85 266X+154 568(n=6)，r=0.999 8，表明槲皮素进样的浓度在10~100 μg/ml范围呈良好的线性关系。

2.2.6精密度实验分别取对照品溶液和供试品溶液，各连续重复进样6次，测定样品中槲皮素峰面积积分值并计算相对标准偏差，测得对照品溶液平均值为：3 258 144，RSD=0.60%;供试品溶液平均值为：4 097 378，RSD=1.62%。

2.2.7稳定性实验取供试品溶液，在上述色谱条件下，10 h内间隔一定时间进样，测定样品中槲皮素峰面积积分值并计算相对标准偏差，测得平均值为：4 129 149，RSD=1.47%。

2.2.8重复性实验精密称取同一批余甘子叶样品各6份，按“供试品溶液的制备”项下进行操作，测定槲皮素的含量(mg/g)并计算相对标准偏差，结果测得槲皮素平均含量为7.008 7 mg/g，RSD=1.75%(n=6)。

2.2.9加样回收率实验分别精密称取已测知槲皮素含量(7.0087 mg/g)的余甘子叶粉末样品，共9份，每份0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按低(0.607 2 mg)、中(0.708 4 mg)、高(0.809 6 mg)3个不同的加入量，精密加入槲皮素对照品溶液(1.012 mg/ml)。混匀后按供试品溶液制备和槲皮素含量测定方法提取、测定，计算平均回收率，结果平均回收率为101.0%，RSD=1.89%。

2.2.10样品测定取不同产地余甘子叶样品，按上述方法进行含量测定。结果见表2。表2余甘子叶中槲皮素含量测定结果

3讨论

本实验建立了余甘子叶中槲皮素的定性定量分析方法，方法简便、快速，专属性强，重现性好，可作为余甘子叶的质量控制方法。本实验测定了不同产地的余甘子叶，结果均能检出槲皮素，但含量有所差异，且相差较大。流动相的配比对槲皮素的色谱峰有较大影响，甲醇-0.2%磷酸为60∶40时，槲皮素出峰时间较快，样品中槲皮素峰未能与其他杂质峰有较好地分离;甲醇-0.2%磷酸为50∶50时，槲皮素出峰时间相对较慢，但与相邻峰的分离效果最好，色谱峰形对称，因此选择50∶50的流动相配比。