乙型肝炎病毒基因变异的临床病毒学分析

摘要：乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科，为双链DNA病毒，其长链(负链)携带了病毒的全部遗传信息，包含4个部分重叠的开放读码框架。由于乙型肝炎病毒聚合酶/逆转录酶缺乏纠错功能，导致病毒基因变异的发生十分常见。乙型肝炎病毒基因变异可以引起病毒生物学特性的改变，在引发疾病的临床表现、诊断、预后和预防等方面带来一系列新的问题。本文综述了目前国内外对乙型肝炎病毒4个开放读码框架内基因变异的研究状况，以期为乙型肝炎的临床诊治提供参考。

关键词：肝炎病毒，乙型；基因；变异(遗传学)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)的基因组由长度为3200个碱基对、部分双链的环状DNA分子构成，含有4个部分重叠的开放读码框架(Open Reading Frame，ORF)，即S ORF、C ORF、P ORF和X ORF。HBV的聚合酶(Polymease，Pol)/逆转录酶(Reverse Transcriptase，RT)缺乏纠错功能，允许复制错误发生。复制错误将导致多种不同的HBV准种的出现。

1 S ORF变异

HBV DNA的S ORF包括前-S1区、前-S2区(两者合称前-S区)和S区，编码产物最基本的功能是构成HBV Dane颗粒的包膜蛋白。目前的研究认为，S ORF编码的大蛋白具有反式激活功能，与HBV的复制密切相关，而且血清大蛋白的检测对评估慢性乙型肝炎患者的病毒感染状况和隐匿性HBV感染患者的检出具有重要意义[1-2]。

前-S1区和前-S2区与P基因的空白区重叠，这两个区域都具有B细胞和T细胞的识别位点。一些前-S1区的变异可以导致被截断的大蛋白在胞浆内的积聚，这会抑制病毒的分泌并具有细胞毒效应。但是，Gao等[3]研究发现，在有的肝癌患者体内，大蛋白完全缺失的HBV也可以成为优势种群，他们认为，是患者体内的野生型前-S蛋白修复了这种缺陷，即体内的野生株HBV帮助了这种缺陷病毒株，确保了其在体内的存活。前-S2区变异包括前-S2ATG的缺失或错配，引起蛋白合成终止以及B细胞和T细胞表位的缺失或改变。前-S变异经常出现在应用干扰素治疗的患者中[4]。前-S区的缺失变异会影响大蛋白对小蛋白的比例，导致与肝病恶化相关的内质网压力过大，进而引发大蛋白或中蛋白与宿主染色体整合，增加了肝细胞癌变的可能[5]。Mun等[6]研究发现，前-S区缺失的频率随肝脏疾病的临床严重程度逐渐增加，但前-S1和前-S2的缺失频率是有差别的，前-S1缺失在肝细胞癌患者中发生率最高，而前-S2缺失在肝硬化患者中发生率最高。

S区点变异可导致逃逸变异株的出现，变异通常发生在HBsAg a抗原决定簇区域，目前报道较多的变异形式多为sG145R[7]。此外，基因分析表明，sP120A变异与HBsAg血清抗体转换有关，这种变异降低了抗-HBs的结合作用，使HBsAg的检测失败[8]。文献报道，有10个S基因变异与疫苗免疫逃逸相关，分别是sP120T、sI/T126N/A、sQ129H、sM133L、sK141E、sP142S、sD144A、sG145R、sF158Y和sF161Y[9]，但这些变异的临床意义还有待进一步研究。

2 C ORF与X ORF变异

HBV DNA的C ORF包括前核心区和核心区，有各自的翻译起始密码子ATG，分别编码前核心蛋白和核心蛋白。

前核心蛋白经过修饰最终形成可溶性抗原HBeAg。核心启动子变异和前核心变异均会影响HBeAg的表达。HBV DNA的X ORF编码HBx蛋白。HBx蛋白是一种多功能病毒蛋白，具反式激活作用。

在从HBeAg-/抗-HBe+的患者体内分离到的病毒株中，A1762T和G1764A双重变异是最常见的BCP变异形式。

这种变异会引起HBx蛋白结构中两个氨基酸的变化进而影响HBx蛋白的活性以及改变病毒增强子的反转录作用[10]，与肝细胞癌的发生关系密切[11]。Fang等[12]通过3年的纵向病例分析得出，A1762T和G1764A双重变异与HBeAg+患者体内较低的病毒载量有关，但对HBeAg-患者体内的病毒载量没有影响。T1766/A1768变异与暴发性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的发生有关联。Ren等[13]的研究表明，慢加急性肝衰竭(无肝硬化基础)的患者与慢性乙型肝炎患者相比，A1762T/G1764A检出率显著增高。

前核心变异株则通过干扰前核心读码框架而完全终止HBeAg的表达，有时还伴随着起始密码子错配变异和前核心区的框架移位变异。最常见的前核心变异是前核心区28位密码子(Codon 28)由TGG变为TAG(G1896A)。核心区发生变异会终止HBeAg的表达，引起HBeAg阴性肝炎。由于HBeAg与HBcAg有共同的抗原决定簇，缺少HBeAg有可能使表达HBcAg的肝细胞更容易受到免疫细胞的攻击，临床上表现为HBeAg阴性肝炎病情容易出现反复，发生暴发性肝炎(肝衰竭)的几率增高。有研究发现，慢加急性肝衰竭患者的G1896A变异率显著高于慢性乙型肝炎患者[13]。

A1762T/G1764A和G1896A检测有助于区分临床上慢性乙型肝炎急性发作和急性乙型肝炎[14]。

与以上研究相反，有研究者认为，核心启动子变异和前核心变异不会引起肝脏功能失代偿，而是对肝脏功能失代偿起保护性的影响，HBV基因型与肝脏功能失代偿也没有明显的关系[15]。Poustchi等[16]通过研究认为，在慢性乙型肝炎D基因型患者中，BCP A1762T和G1764A双重变异与肝脏疾病恶化相关，而G1757A变异却对宿主有一定的保护作用。

核心区编码基因相对保守，其编码的核心蛋白是宿主免疫反应攻击的主要靶抗原，它的变异可直接影响到宿主对HBV的免疫应答。有研究显示，核心区变异株(G87、V60)与野生株比较，前者可使宿主细胞内HLA-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平降低[17]。Sugiyama等[18]研究认为，核心区A2339G(codon147)变异在体外会增强HBV的复制；而且发生此变异的患有慢性乙型肝炎的儿童和没有此变异的患有慢性乙型肝炎的儿童相比，在血清HBeAg抗体转换之前，前者的ALT峰值较高。

3 P ORF变异

从HBV DNA P ORF的N-末端到C-末端，共涉及4个功能区，即末端蛋白区、间隔区、Pol/RT区、核糖核酸酶H区。RT区又包括7个功能亚区，从RT区上游第1个氨基酸起依次为A、B、C、D、E、F、G亚区。当前所有耐核苷(酸)类药物的基因变异位点都位于RT区。

拉米夫定为胞嘧啶左旋核苷类似物，其耐药变异位于RT区C亚区的YMDD基因序列，最常见的变异为rtM204I/V/S，而A亚区L80I变异以及B亚区rtV173L变异和rtL180M变异为其补偿突变，以维持病毒的复制力[19]。文献报道，拉米夫定也可诱导B亚区rtA181T/S变异[20]。替比夫定为胸腺嘧啶左旋核苷类似物，与LAM均为左旋核苷类药物，分子结构和作用目标位点相似，因此二者存在交叉耐药，常见变异为rtM204I。阿德福韦酯为无环腺苷类似物，RT区D亚区rtN236T变异与B亚区rtA181V变异是ADV的常见耐药变异形式。有文献将rtA181T变异也归为阿德福韦耐药变异，但还尚存争论[20]。恩替卡韦为鸟嘌呤核苷类似物，其耐药特点是发生在拉米夫定耐药的背景上，耐药位点是在LAM耐药位点基础上另加B亚区T184、S202和/或M250变异。

此外，在未应用过核苷(酸)类药物治疗的慢性乙型肝炎患者中，YMDD基因序列变异的发生率从1%-27%不等[21]。

因此，有必要在应用核苷(酸)类药物治疗前对患者进行HBV耐药变异检测[22]。

4小结

HBV是一种高变异的嗜肝DNA病毒。HBV基因变异可以在宿主自身免疫应答、病毒复制适应性等内因的影响下发生，也可以发生于核苷(酸)类药物或疫苗接种等外因作用之后。HBV变异是影响其感染发生、发展和转归的重要因素。HBV基因变异常常引起病毒生物学特性的改变，在引发疾病的临床表现、诊断、预后和预防等方面带来很多新的问题。

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