关于硝酸咪康唑搽剂微生物限度检查法的建立

【摘要】 目的 建立硝酸咪康唑搽剂微生物限度检查法。方法 测定硝酸咪康唑搽剂对大肠埃希菌等5种试验菌的回收率，对2个控制菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌）的检查方法进行验证。结果 用薄膜过滤法和0.1%吐温80-pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作冲洗剂检查本品的细菌总数、真菌及酵母菌计数，其试验菌回收率均达到70%以上。同样用该方法检查本品的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，其试验组呈阳性反应，阴性菌对照组呈阴性反应。结论 用薄膜过滤法联用0.1%吐温80-pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作冲洗剂可以消除硝酸咪康唑搽剂在试验条件下的抑菌作用，从而顺利检出该品种所污染的各种微生物。 【关键词】 硝酸咪康唑搽剂；微生物限度检查；方法学验证 Abstract:Objective To establish a method of microbial limit test for miconazole nitrate liniment. Methods Centrifugal sedimentation and culture medium diluted method were used to validate the accuracy and feasibility of microbial limit test.Results The recovery of bacteria， yeast and mould were above 70%. P. aeruginosa and S.aureus were positive and Gramnegative organisms were negative. Conclusions Membrane filtration and the polysorbate 80 sodium chloridepeptone buffer can be used to test the total viable aerobic count and specifiedorganisms (include S. aureus and P. aeruginosa) for miconazole nitrate liniment. Key words:miconazole nitrate liniment；microbial limit test；method validation 微生物限度检查法是检查非规定制剂及原料、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括细菌数、真菌数、酵母菌数及控制菌检查［1］。但具有抑菌成分的药品由于其抑菌活性的干扰，常规检查结果不能真实地反映出药品中污染微生物的情况，必须先消除供试品中的抑菌活性，再根据《中国药典》规定的方法进行检查，并必须对所采取的检查方法进行验证，以确认抑菌活性的消除和检查方法的可靠性。具有抑菌作用的药品，每个品种抑菌效果不同，因此适合各个品种的微生物限度检查法也不同。 作者曾用常规法、培养基稀释法及薄膜过滤法（用pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗）对硝酸咪康唑搽剂进行微生物限度检查，结果均不能达到药典要求。吐温80是亲水性表面活性剂，具有增溶作用，因此本文选择用薄膜过滤法联用0.1%吐温80pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲溶液做冲洗剂检查该药品的细菌、真菌、酵母菌数和控制菌，结果满意，可为同类药品的微生物限度检查法提供科学依据。 1材料 1.1菌种大肠埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B) 44 102］， 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B) 26 003］， 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)［CMCC（B）63 501］， 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B) 26 003］，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC(B)10 104］白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F) 980011］， 黑曲霉(Asperg illus niger)［CMCC(F) 98003］，由广东生物研究所提供，菌种代数均为第3代。 1.2培养基及试剂pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液、0.1%吐温80pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液、营养肉汤、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、虎红培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂、二盐酸二甲基对苯二胺试剂、PDP琼脂培养基、三氯甲烷、甘露醇氯化钠琼脂培养基和革兰氏染色剂。 1.3样品硝酸咪康唑搽剂，阿特维斯（佛山）制药有限公司，批号：0606950，成分：硝酸咪康唑、玫瑰麝香香精、乙醇、二甲基亚砜。 2方法与结果 2.1菌液制备［1］ 2.1.1取经37 ℃ 培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌与大肠埃希菌的肉汤培养物1 mL，加入9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释并制成每1 mL中含菌数50～100 cfu的菌悬液，做活菌计数。 2.1.2取经25 ℃培养18～24 h的白色念珠菌液体培养物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释并制成每1 mL中含菌数50～100 cfu的菌悬液，做活菌计数。 2.1.3接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7 d，加入3～5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含孢子数50～100 cfu的孢子悬液，做活菌计数。 2.2供试液的制备［2］取本品10 mL，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀，作为1∶10的供试液。 2.3验证方法 2.3.1细菌、真菌和酵母菌计数法回收率的测定 薄膜过滤法联用0.1%吐温80pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲溶液作冲洗剂对各试验菌的回收率进行实验，3次独立平行试验结果的均值见表1［3］。

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