y大鼠肺动脉平滑肌细胞钾通道的电生理学特性

【摘要】 目的：研究大鼠肺动脉平滑肌细胞钾通道的电生理学特性。方法：用急性酶分离法分离单个大鼠肺动脉平滑肌细胞，采用全细胞膜片钳技术对肺动脉平滑肌细胞钾通道的电生理学特性进行研究。结果：在一定的实验条件下可记录出钙激活性钾电流(Kca)和电压门控性钾电流(Kv)。Kca可被四乙胺阻断，Kv电流由快速失活K+电流(Ka)、缓慢失活钾电流(Kst)和延迟整流K+电流(KDR)以不同比例复合而成，可被四氨基吡啶所阻断。结论：利用膜片钳技术研究发现，低氧通过作用K+通道引起肺动脉平滑肌细胞收缩。

【关键词】 大鼠;肺动脉;平滑肌细胞;k+通道;全细胞膜片钳

迄今大多数学者认为低氧性肺动脉高压(PAH)以及低氧性肺血管收缩(HPV)的发病机理是由于低氧抑制了平滑肌细胞膜上的钾离子通道，使细胞膜去极化，从而激活电压门控的钙通道，引起细胞外钙离子内流，致肺动脉平滑肌细胞收缩，从而启动HPV[1]。K+通道既是PAH和HPV发病过程中的重要环节，也是药物作用的重要靶点[2]。基于此，我们利用传统的全细胞膜片钳技术对急性分离的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PaSMCs)k+通道的电生理学特性进行了研究，旨在进一步阐明PAH和HPV的发病机理，为药物的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年雄性Wistar大鼠，体重270±30g(购于四川大学医学实验动物中心)。

1.2 试剂

试剂：胶原酶Ⅺ、HEPES、小牛血清白蛋白、papain、四乙胺(TEA)、4-氨基吡啶(4-AP)、EGTA、dithiothreitol(DTT)等试剂购于SIGMA公司，其余试剂为国产分析纯。

溶液配制： 细胞分离液(HPSS)(mmol·L-1)：NaCl 130，KCl 5，MgCl2 2.5，HEPES 10，Glucose 10，PH 7.3 (with NaOH);低钙的HEPES液：CaCl2 20umol/L;电极内液(mmol·L-1)：KCl 110，MgCl2 2.5，Na2ATP 5.0，HEPES 10，EGTA 10，PH 7.2。

1.3 仪器和材料

解剖显微镜(OLYMPUS SZX12，Japan)、倒置相差显微镜(OLYMPUS IX70，Japan)玻璃微电极拉制仪(Sutter Instrument co， USA)、毛细玻璃微管电极(硬质，购于中国科学院电子所)、玻璃微电极抛光仪(NARISHIGE，Japan)、膜片钳放大器(Axon Instruments，USA)、电子三维微操纵仪(Sutter Instrument co，USA)、12位A/DD/A数模转换器(Digidata 1200 series Interface， USA)、膜片钳刺激程序设置和电信号数据记录软件：Clampex8.1、膜片钳电信号数据处理和分析软件：Clampfit 8.1(Axon Instruments， USA)。

1.4 大鼠肺动脉平滑肌细胞的急性酶分离

单个大鼠肺动脉平滑肌细胞的获得参照Smirnov、肖欣荣等使用的急性酶分离法分离[3-4]。大鼠用1%戊巴比妥钠以33 mg·kg-1的进行腹腔麻醉后剖胸，游离支气管、心脏和肺，放在细胞分离液(4℃)HPSS中，清洗淤血后，将标本置于冰浴的琼脂盘上，在体视显微镜下沿着右心室分离出左右肺动脉，清理结缔组织，顺肺动脉主干分离肺动脉的分支， 去掉肺动脉主干及1级分支，最后保留2-4级肺动脉分支(φ<1000 μm)。将动脉管沿纵行方向剖开，将血管壁剪成1×1mm2的组织小片。置组织小片于1.5ml的低钙HEPES液中(CaCl2 20 μmol·L-1)，内含胶原酶Ⅺ 1 mg·ml-1，木瓜蛋白酶1mg·ml-1，小牛血清白蛋白2mg·ml-1，DTT 1 mM·L-1，在37℃的恒温水浴箱中孵育酶解40 min，低速离心(1000gr·M-1)5 min，无钙HPSS液洗涤两次后低速离心5 min，弃上清液，加入低钙HEPES液4 ml，用尖端抛光、开口较大的Pasteur吸管轻柔地吹打20 min，即得到单个的肺动脉平滑肌细胞。

1.5 大鼠肺动脉平滑肌细胞全细胞膜片钳记录

选择细胞形态自然、包膜光滑、包质均匀、折光性好的平滑肌细胞进行全细胞膜片钳记录[5-7]。反向将经过过滤的平滑肌细胞电极内液冲灌电极，用微操纵仪移动电极进入平滑肌细胞细胞外液中。细胞封接时，让电极接触细胞表面，轻压成小凹，缓慢释放预先施加在电极内的正压，如果细胞状态好，在30-60s的时间内里即能形成高阻抗封接，达1 GΩ以上，封接很好时可达10GΩ以上。给电极内大约10cmH2O的负压，细胞很快被吸破，此时可见电流电容突然增大，表明已形成全细胞模式。设定输出增益：×1、低通滤波频率：5KHz、采样频率：2KHz，采样间隔100ms。并由Clampex8.1软件设置膜片钳刺激程序和记录电信号。数模转换器(Digidata 1200 series Interface)进行数字信号和模拟信号的转换。

1.6 统计学处理

实验所得数据采用pClamp8.1、SPSS10.0及Excell软件进行处理和分析。实验结果用x±s表示，给药前后差异的显著性用t检验进行分析。

2结果

2.1 平滑肌细胞膜上综合性的K+电流

在室温25℃，钳制电压设定为-70mv，给予-90mv到+60mv的阶跃电压，步阶电压为10mv，刺激时间为300ms。当细胞浴液含CaCl2 1.5mmol·L-1，电极内液含Na2ATP 5.0 mmol·L-1及EGTA 0.1 mmol·L-1时，电极内液高浓度的Na2ATP抑制了KATP通道的活性，故此时记录不到KATP电流的存在;因为细胞外液含有生理浓度的Ca2+，同时电极内液Ca2+螯合剂的浓度很低，所以记录到的电流既包含有Kv，又包含有Kca的成分。见图1中A图，从A图可见电流图不太光滑，噪声较大，加入特异性的Kca通道阻断剂TEA (Tetraethylammonium，四乙基胺)5mmol·L-1后，得到的电流图噪声明显减低，曲线变光滑(参见B图)，表明Kca电流成分被所TEA抑制，仅剩下Kv电流。为了验证是否为Kv电流，接着我们又加入Kv通道特异性的阻断剂5mmol·L-1的四氨基吡啶(4-Aminopyridine，4-AP)，约4min后可记录得到C图，从C图可见到电流进一步受到抑制。将A图与B图、B图与C图分别相减得到D图与E图，分别为TEA和4-AP所抑制的电流成分，可见Kca电流所占的比例较Kv小。将A、B、C 3幅图作I-V曲线后得到F图。

2.2 电压激活性K+电流(IKv)

图2 A:电压激活性K+电流

B：62个肺动脉平滑肌细胞膜上记录到的IKV的电流电压关系曲线

在同样的刺激程序下，单纯仅仅希望记录到IKv时，将细胞浴液中1.5mmol·L-1 的CaCl2换成等摩尔浓度的的MgCl2，同时在细胞浴液中加入2mmol·L-1的EGTA，在电极内液中加入10mmol·L-1的EGTA，在此条件下，记录到的电流基本是Kv电流。这些电流表现为噪声很低，曲线很光滑，与Kca电流有明显的不同(见图2A)。选择记录良好的62例Kv电流图，以膜电位为横坐标，各个电位下所记录的电流值与+60mv时所得到的最大电流值相比较得到的百分比为纵坐标，绘制出I-V曲线(图2B)。这样可消除由于细胞大小不一，从而使得电流值也不一样而造成的误差。从I-V曲线我们可见到记录的k+ 电流呈现明显的外向整流特性，k+的反转电位即零电位水平均在-70mv左右，这与大多数文献所报道的一致。在所记录的62例平滑肌细胞中，k+ 电流激活的阈电位为-60mv左右，高于此电位的去极化均可激活k+通道。

为了验证所记录到的电流为Kv电流，我们用4AP(4Aminopyridine，四氨基吡啶)，一种特异性的Kv通道阻断剂，加到培养皿中，看其对电流是否有影响。先记录一个未加药的对照电流图，如图3A所示，然后向培养皿中加入定量4AP使其终浓度为5mm·L-1，在等待约4min后重新记录加药后的电流图形，如图B所示，可见电流受到明显抑制，将图A和图B相减，得到图C。可见到加入4AP 5mM·L-1，KV通道被抑制，使电流明显减小，且4AP对Kv电流的三种成分均有不同程度的抑制。以膜电位为横坐标，各电流值与加药前+60mv水平的电流值相比得到I/Imax为纵坐标，分别绘制出给药前后的IV曲线，可见4AP使得K+电流的IV曲线显著下移，即减小钾电流，但在不同膜电位下的减小程度不同，呈现出电压依赖性，随着电位的增大，抑制程度也越来越大(n=10，图D所示)。在+60mv时，电流仅为对照前的37.08±0.086%，抑制了近65.51±11.84%，具有显著的统计学意义(n=10，P<0.01)。

2.3 钙激活性钾通道(Kca)

在细胞浴液含CaCl2 1.5mmol·L-1、4-AP 5mmol·L-1，电极内液含EGTA 0.1mmol·L-1的情况下，可记录到噪声很大，去极化后缓慢达到最大值的失活很慢或基本不失活的电流。这与文献报导的Kca电流的特征相一致(见图4A)[11]。为了验证是否为Kca电流，我们将该通道的特异性阻断剂TEA 5mmol·L-1加入到培养皿中，以观察电流的改变(见图4B)，可见TEA可使Kca电流受到明显抑制。

图4 A:记录到的典型的Kca电流 B：加入TEA电流图形受到明显抑制

3 讨论

K+通道对血管紧张度的维持和血管功能的调节有很重要的意义，它参与维持血管平滑肌细胞的膜电位，亦是众多血管活性物质的作用靶点，在PAH和HPV的发病机理中起重要作用[9]。对PaSMCs的电生理学特性进行研究，为进一步的研究PAH和HPV的发病机理有很重要的意义。

本实验重点记录了Kca与Kv两种通道的电流，在PaSMCs没有观察到快Na+ 电流，这与报道的结果一致。全细胞膜片钳技术记录的电流是宏膜电流，包括不只一种通道电流，而平滑肌细胞膜上的电压门控性离子通道也不只一种，在分离每种通道电流时，在一定的实验条件下，如控制灌流液的温度、特定的protocol以及特异性的工具药在一定条件时，可将另外一种或几种通道电流阻断，从而得到希望的电流。在设定的实验条件下，我们所记录到的K+电流不含KATP与Kir。在包含有Kca与Kv的综合性的K+电流中用5mmol·L-1的TEA可消除由于Kca的存在使曲线不光滑的部分，继续加用4AP则使电流更进一步的抑制，而单独记录出的Kca电流表现为激活缓慢，噪声很大，这与文献[8]报道的Kca电流的特征一致，加用TEA后使电流受到明显抑制，更进一步证实了记录的电流为Kca电流;接着加用Kv通道特异性的阻断剂4AP，可进一步使电流受到明显地抑制，证明该成分为Kv电流。最近的研究表明虽然高浓度的TEA 和4AP对阻断Kca 和KDR 无特异性，但在浓度时阻断的Ik成分确实不同。≤5mmol·L-1的TEA可特异性的阻断Kca通道的电流，而≤5mmol·L-1的4AP可特异性的阻断TEA和CTX(Charybdotoxin，另一种特异性的Kca通道阻断剂)不敏感的K+通道的电流即Kv。

我们在单个PaSMCs上证实有Kv存在，它们在膜去极化时被激活，引起外向的整流性的K+电流，加用Kv通道特异性的阻断剂4AP后可使电流受到明显的抑制，如图3所示。据电压依赖性和药理学的差异，Kv可分为Ka、Kst及KDR，每一个细胞记录到的Kv电流是由这3种成分以不同比例复合而成，根据形状和各种成分比例的不同可将其分为4类，如图A至D所示。Ka(短暂外向性钾通道)电流的激活是电压和时间依赖性的，其介导的电流是在细胞去极化早期出现的外向性钾电流，其特点是具有电压依赖性的快速激活和灭活，是早期复极化电流，图1A记录的电流以Ka为主，图E中IV曲线显示了图A中峰值电流与稳态电流的明显差异。而图D则呈明显的KDR的特征，激活缓慢或基本不失活。从A图到D图Kv电流激活的时间常数逐渐增加。根据文献[10]Kv包括多种亚型，根据分子生物学分类分为Kv1、Kv2、Kv3、Kv4、Kv5、Kv6及Kv9，每型又按发现克隆的次序进一步分类，其中Kv1.4为Ka，实验中我们每个细胞记录到的全细胞Kv电流形状都不完全一样，估计与每一次记录的PaSMCs所包含的Kv亚型所含的比例不同有关。