阿奇霉素微生物限度检查方法分析

【摘要】目的建立阿奇霉素原料的微生物限度检查方法。方法 采用离心沉淀、薄膜过滤与冲洗液加入增溶剂并保温的方法消除阿奇霉素的抗菌活性。结果 各试验菌的回收率均大于70%，控制菌结果呈阳性。结论 该方法可作为阿奇霉素原料的常规微生物限度检查方法。

【关键词】阿奇霉素 薄膜过滤 离心 增溶剂

阿奇霉素是新一代大环内酯类抗生素，为红霉素结构修饰的产物，主要通过与敏感微生物的50S核糖体作用抑制细菌蛋白质的合成起作用。与红霉素相比，其抗菌谱有所扩大，抗菌活性也有所增强。[1]阿奇霉素原料作为生产各类阿奇霉素制剂的主要物料，其卫生学水平须达到相应制剂的水平。本组试验所用阿奇霉素原料主要用于生产口服制剂，根据《中国药典》2010年版要求，口服制剂须进行细菌、霉菌及酵母菌以及大肠埃希菌检查，故本次试验对阿奇霉素的细菌、霉菌及酵母菌计数、控制菌检查分别进行讨论。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Milliflex Plus Pump（密理博）、TDL-40B低速台式大容量离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司）、电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）、 ZF-I型三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）、LRH-250F型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、HH-S6 数显双列六孔水浴锅（金坛市医疗仪器厂）0.45μm 混合纤维素酯膜（密理博）

1.2 供试品

阿奇霉素（南京先声东元制药有限公司提供）。

1.3 培养基与缓冲液

营养琼脂培养基（批号：110307）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：1102212）、 胆盐乳糖培养基（批号：1012012）、MUG培养基（批号：101020）、营养肉汤培养基（批号：101124）均购自北京三药科技开发公司。各培养基适用性根据《中国药典》2010年版检查均符合规定。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：20110419）购自青岛蓝雁绿检生物技术有限公司。

1.4 菌种

大肠埃希菌[CMCC (B) 44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC (B) 26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC (B) 63501]、白色念珠菌[CMCC(B)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]均购自中国药品生物制品检定所，所有试验菌传代次数均不超过5代。

2 方法[2]和结果

2.1 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基斜面上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用含0.05%（ml/ml）吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

2.2 供试液制备

称取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10供试液。细菌计数及控制菌检查取1:10供试液80ml于500rpm离心2分钟，备用。霉菌及酵母菌计数取未经离心的1:10供试液，备用。

2.3 回收率计算

试验组：取供试液，照下列2.4及2.5项的计数方法，培养基稀释法取供试液及试验菌混匀后倒培养基计数，薄膜过滤法在最后一次冲洗液中加入试验菌过滤后将滤膜贴在培养基平板上计数。

菌液组：取各试验菌，与试验组相同（不加供试品）操作后计数。

供试品对照组：取供试液，与试验组相同操作（不加试验菌）后计数。

稀释剂对照组：用等量稀释剂代替供试液，与试验组相同操作后计数。

试验组回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落）/菌液组平均菌落数×100%；

稀释剂对照组回收率=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组回收率×100%。

2.4 细菌计数方法验证试验

细菌计数取1:10供试液离心后的上清液作为供试液，分别用培养基稀释放、薄膜过滤法试验。培养基稀释法取供试液1ml平均分配至5个培养皿中，再分别加入50～100cfu/ml的试验菌1ml，注入45℃的营养琼脂培养基计数；薄膜过滤法取供试液1ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，过滤，分别用不加处理的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液及加入吐温-80并预先于45℃保温的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗。结果见表1和表2。

表1 阿奇霉素原料细菌计数培养基稀释法试验结果

表2 阿奇霉素原料细菌计数薄膜过滤法试验结果

2.5 霉菌及酵母菌计数验证试验 霉菌及酵母菌计数取未经离心的1:10供试液采用平皿法和培养基稀释法同时试验。培养基稀释法取1ml供试液平均加至2个培养皿中，0.5ml/皿，再分别加入1ml的试验菌，倾注玫瑰红钠琼脂培养基后培养计数。结果见表3。

表3 阿奇霉素原料霉菌及酵母菌计数试验结果

2.6 控制菌检查验证试验

根据《中国药典》2010年版二部，原料及辅料的微生物限度标准参照相应制剂的微生物限度标准执行。本次试验所用阿奇霉素原料用于口服制剂，故须进行控制菌大肠埃希菌检查。

本次控制菌检查试验取1:10供试液离心后的上清液作为供试液，取供试液10ml，分别用加吐温-80并保温的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液及未经处理的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗。结果见表4。

表4 阿奇霉素原料控制菌检查试验结果

3 讨论

阿奇霉素是非水溶性抗生素，其对细菌具有很强的抗菌活性，对真菌基本无抗菌活性。[3][4]与阿奇霉素的制剂相比，阿奇霉素原料所制备的供试液所含阿奇霉素浓度过高，对细菌的抑菌性过强，为阿奇霉素原料的微生物限度检查带来了很大的难度。

本次试验中，霉菌及酵母菌计数采用平皿法试验，各试验菌的回收率均大于70%，表明阿奇霉素对真菌基本无抗菌活性，日常阿奇霉素原料的霉菌及酵母菌计数可采用平皿法进行；控制菌检查中，取1:10供试液10ml，用pH7.0缓冲液冲洗700ml，试验组即检出了大肠埃希菌，表明阿奇霉素对大肠埃希菌的抗菌活性不强；细菌计数试验中，常规的薄膜过滤法（冲洗pH7.0缓冲液900ml）各试验菌的回收率均低于70%，表明普通的薄膜过滤法无法消除阿奇霉素的抗菌活性。笔者在冲洗液中加入浓度为0.1%的增溶剂吐温-80并将冲洗液于45℃保温，试验菌的回收率有明显改善，冲洗900ml的条件下所有试验菌的回收率均大于70%，表明该方法能有效的消除阿奇霉素的抗菌活性。

以上试验结果表明，在对脂溶性抗生素进行微生物限度检查时，在冲洗液中加入增溶剂并将冲洗液于适当的温度保温能够改善样品在冲洗液中的溶解性，提高冲洗的效果，在普通薄膜过滤法效果不佳时可作为改进试验条件的首选方法。

参 考 文 献

[1] 胡永福，张燕梅，梁丽萍.阿奇霉素制剂研究概况[J].河北医药，2009，31(16):2120-2122.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].（二部）.北京：中国医药科技出版社，2010，附录107-116.

[3] 董毅. 大环内酯类抗生素的研究进展[J].国外医药.合成药.生化药.制剂分册， 2001， 22(3) : 134-135.

[4] 刘玉娥， 刘继兰， 曹中兴.大环内酯类抗生素的研究进展[J].中华医院感染学杂志， 2003， 13(4): 395-396.