关于罗红霉素干混悬剂微生物限度检查法的建立与验证

作者：雷柳冰 巫彬毅 曾丽玲

【摘要】目的 建立罗红霉素干混悬剂微生物限度检查法与验证。方法 薄膜过滤法，用含5%乙醇的0.1%蛋白胨溶液500ml分5次冲洗滤膜。结果 各控制菌回收率均在70%以上。结论 该方法可行。

【关键词】罗红霉素干混悬剂 微生物限度 薄膜过滤法

罗红霉素干混悬剂为半合成的14元环大环内脂类抗生素，适用于化脓性链球菌引起的咽炎及扁桃体炎，敏感菌所致的鼻窦炙、中耳炎、急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作，肺炎支原体或肺炎衣原体所致的肺炎，沙眼衣原体引起的尿道炎和宫颈炎，敏感细菌引起的皮肤软组织感染[1]。本实验采用薄膜过滤法，用含5％乙醇的0.1％无菌蛋白胨溶液冲洗滤膜，对该品种进行微生物限度检查，各控制菌回收率在70%以上，表明该方法可行。?

1 仪器与试药

1.1 仪器：HTY-2000集菌仪、集菌培养器（孔径为0.45μm），HH.BII.420电热恒温培养箱、LRH-250A生化培养箱、Sartorius BS 2002S电子天平、SA-1480-Ⅱ净化工作台。

1.2 培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基、MUG培养基，均购于中检所。

1.3菌种：枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003（以上菌株均为第三代），均购于中检所。

1.4 菌液制备

1.4.1 取经30℃～35℃培养18～24小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养液1ml，加0.9%无菌氯化钠至每ml含菌50～100cfu。

1.4.2 取经23℃～28℃培养24～48小时的白色念珠菌改良马丁培养液1ml，加0.9%无菌氯化钠至每ml含菌50～100cfu。

1.4.3 取经23℃～28℃ 培养5～7天的黑曲霉改良马丁营养琼脂斜面，用0.9%无菌氯化钠3～5ml将孢子洗脱，加0.9%无菌氯化钠至每ml含菌50～100cfu

2 实验方法

2.1 细菌霉菌及酵母菌检查方法的验证

2.1.1 供试液的制备 取供试品10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100g，作为1：10的供试液。

2.1.2 方法验证过程 验证试验进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌的回收率。

2.1.2.1 实验组 取1：10供试液1ml，加入50ml含5％乙醇的0.1％无菌蛋白胨溶液中，摇匀，立刻过滤，滤膜用500ml含5％乙醇的0.1％无菌蛋白胨溶液冲洗后，用注射器加入菌液1ml，滤干，取滤膜培养。每株菌株（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）各做1份试验。

2.1.2.2 菌液组 取菌液1ml加入平皿中，立刻加入相应的琼脂，各菌株做2份平行试验。

2.1.2.3 供试品对照组 按试验组的方法不加菌液，测定供试品的本底菌数。

2.1.2.4 稀释剂对照组 取上述菌液（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉）各1ml， 加入50ml含5％乙醇的0.1％无菌蛋白胨溶液中，滤过，滤膜用500ml含5％乙醇的0.1％无菌蛋白胨溶液分5次冲洗后，滤干。取滤膜培养。每株菌株（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）各做1份试验。

2.1.3 计算公式

实验组的菌回收率=（实验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数）/菌液组的平均菌落数

稀释剂对照组的菌回收率=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组的平均菌落数

2.1.4 评价标准 细菌、霉菌及酵母菌回收率试验采用先制成1：10供试液，再用薄膜过滤法检查，试验组的回收在70%以上，表明可用上述方法检查细菌、霉菌及酵母菌。

2.1.5 结果

经过培养和计数，控制菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及黑曲霉）的回收率结果如表1、表2。

表1 试验组回收率结果

表2 稀释剂对照组回收率结果

从以上二表中的数据可以看出，实验组各控制菌的的回收率均高于70%，稀释既对照组的回收率也高于70%，说明用含5%乙醇的0.1%蛋白胨溶液500ml分5次冲洗滤膜的这种方法可行。

2.2 控制菌（大肠埃希菌）方法验证过程

2.2.1 供试液的制备 方法同2.1.2

2.2.2 方法验证过程

2.2.2.1 试验组 取1：10供试液10ml，加入500ml含5％乙醇的0.1％无菌蛋白胨溶液中，摇匀，立刻过滤，滤膜用500ml含5％乙醇的0.1％无菌蛋白胨溶液分5次冲洗后，用注射器加入大肠埃希菌菌液1ml，滤干，取滤膜加至100ml胆盐乳糖培养基中，于35℃的培养箱中培养18-24h。取培养物0.2ml，接种于5mlMUG培养基中，35℃的培养箱中培养5/24h。

2.2.2.2 阴性对照组 方法同2.2.2.1，大肠埃希菌改为金黄色葡萄球菌。

2.2.3 评价标准 试验组应显大肠埃希菌的特征，阴性对照组不得显大肠埃希菌的特征。

2.2.4 结果 试验组366nm紫外灯下观察呈现荧光，源管壁加入靛基质，液面呈玫瑰红色，显大肠埃希菌的特征反应，阴性对照组无上述现象，不显大肠埃希菌的特征反应，表明上述方法检验罗红霉素干混悬剂方法可行。

3 讨论

3.1 常规法与薄膜过滤法的比较 常规法：取1:10供试液1ml，分别加入5株代表试验菌50～100cfu，立即倾注15～20ml营养琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固置于规定温度培养箱培养24～72h，观察结果，计算菌落数作为试验组，同法测定相应加入的实验均数作为菌液组、测定供试品本底菌数作为供试品对照组，按公式计算回收率均为0。因为罗红霉素干混悬剂为抗生素制剂，有很强的抑菌作用，因此在用常规法测定控制菌的回收率时，罗红霉素的抑菌能力会抑制控制菌的生长，从而影响实验结果的测定，所以验证时不考虑常规法，而是采用薄膜过滤法。

3.2 原因分析 罗红霉素在乙醇或丙酮中易溶，在甲醇中溶解，在乙腈中溶解，在水中几乎不溶[2]。用《中国药典》2010版二部规定的两种冲洗剂，无法除去罗红霉素的干扰，甲醇，乙腈，丙酮有一定的毒性，也不考虑使用，考虑选用乙醇溶解罗红霉素，当用含有乙醇的无菌蛋白胨缓冲液冲洗供试品时，乙醇能够增大罗红霉素在缓冲液中的溶解度，可以溶解供试品中的罗红霉素，从而可以排除罗红霉素对控制菌回收率的影响，使实验结果更具说服力[3]。通过三次实验的验证可以降低每次实验过程带来的误差（如人为因素、环境因素、温湿度影响等），更能体现实验结果的客观性。从表中数据可以得出，用5%乙醇的无菌蛋白胨缓冲液来冲洗滤膜来验证各个控制菌的回收率的方法可行的。

3.3 结论 在罗红霉素干混悬剂的薄膜过滤法中，用不含乙醇的无菌蛋白胨缓冲液来冲洗供试品是不可取的，本研究的目的是验证用含5%乙醇的无菌蛋白胨缓冲液来冲洗滤膜来计算各个控制菌回收率的高低的方法是否可行，结果各控制菌的回收率均大于70%，符合规定，说明此法可行。

参 考 文 献

[1] 中国药典[S]. 二部，2005:附录93-93

[2] 马绪荣，苏德模. 药品微生物检验[M]. 北京:科学出版社，2000:89-90

[3] 中国药品生物制品检定所. 中国药品检验标准操作规范[M]. 北京:中国医药科技出版社，2005.